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promega 小提質粒提取說明書

六肖中特期期准香港免费开 www.slzpo.icu Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System protocol

所用試劑盒為Promega公司的Wizard○R Purefection Plasmid DNA Purification System,能夠去除對細胞有害的細菌內毒素。

具體操作步驟如下:

(1)將5ml 培養過夜的陽性菌在室溫(24℃)下10000×g離心10 min。棄上清,將離心管倒置至吸水紙上去除剩余水分。

(2)加入250μl 重懸液,振蕩至完全重懸。

(3)加入250μl細胞溶解液,顛倒離心管6~8次,徹底混勻。室溫孵育5min。

(4)加入350μl中和液,立即顛倒離心管6~8次,徹底混勻。

(5)室溫下10000×g離心細菌溶解產物20min,上清移至新的1.5 ml 離心管,再次離心20 min,將上清移至新離心管。

(6)徹底搖勻除內毒素樹脂,加50μl到離心管中,室溫孵育10 min,在孵育過程中每隔3 min劇烈振蕩5 sec。

(7)將離心管放置于磁珠分離架使溶液變清,顛倒磁珠分離架和離心管,去除附著在離心管壁和頂蓋上的液體。放置至液體澄清后30 sec,吸取上清至新離心管,棄去沉淀。

(8)加入200 μl GTC(5M/L),與上步分離的上清劇烈振蕩混和。如果GTC產生沉淀,37℃加溫10min,冷卻到25℃使用。

(9)徹底重懸磁珠,加150 μl至溶液中,劇烈振蕩混和,室溫孵育2~3 min。

(10)將離心管放置于磁珠分離架使溶液變清,顛倒磁珠分離架和離心管,去除附著在離心管壁和頂蓋上的液體。放置至液體澄清后30 sec,棄上清,離心管繼續放置2~3min,去除剩余液體。

(11)將離心管從磁架上取出,加入200 μl 4/40洗脫液。劇烈振蕩15sec 重懸磁珠微粒。4/40洗脫液可以去除無關蛋白,如核酸酶。

(12)將離心管放置于磁珠分離架使溶液變清,顛倒磁珠分離架和離心管,去除附著在離心管壁和頂蓋上的液體。放置至液體澄清后30 sec,棄上清,離心管繼續放置2~3min,去除剩余液體。

(13)將離心管從磁架上取出,加入1.0 ml 80%乙醇洗滌微粒。劇烈振蕩10sec,將離心管放置于磁珠分離架使溶液變清,顛倒磁珠分離架和離心管,去除附著在離心管壁和頂蓋上的液體。放置至液體澄清后30 sec,棄上清,離心管繼續放置2~3min,去除剩余液體。

(14)重復操作步驟(13)兩次。

(15)洗滌完最后一遍后,打開離心管蓋,放置在磁珠分離架10min,去除殘余液體。

(16)將離心管從磁架上取出,加入240 μl 去離子水,振蕩10sec,在室溫孵育1min。將離心管放置于磁珠分離架使溶液變清,顛倒磁珠分離架和離心管,去除附著在離心管壁和頂蓋上的液體。放置3 min后,將上清小心移至新離心管中。14000g離心10min,上清移至新管中,同時計算上清體積。

(17)加入0.5體積醋酸銨(7.5M/L)和2.5體積95%乙醇,混勻后室溫下14000×g離心15 min。小心吸出上清,用1ml 70%乙醇洗滌沉淀,室溫下14000×g離心5 min。小心吸去上清,空氣中干燥5 min,用30 μl去離子水溶解。

(18)分別取1ul,2ul,3ul反應產物電泳,估計質粒濃度。

(19)用分光光度計測OD值及核酸濃度。

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